(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

紫外交聯(lián)儀技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 能有效的處理土壤樣品中一些很難處理的組分如: 真細(xì)菌孢子(eubacterial spores)、內(nèi)芽孢(endospores)、格蘭仕陽性菌(gram positive bacteria)、酵母(yeast)、線蟲(nematodes)、海藻(algea)、真菌(fungi)等。

2. 樣品處理過程中使用的 MT Buffer和Sodium Phosphate Buffer可在整個(gè)提取過程中有效的保護(hù)核酸,并wu限度的降低RNA污染。

3. 基于硅珠的純化方法,可有效地去除腐植酸、多元酚等PCR抑制物

4. 純化所得的DNA可直接用于PCR、酶切等后續(xù)實(shí)驗(yàn)之中。

5. 對(duì)腐植酸含量特別高的樣品,附加額外的處理方法。